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          提高效率與質量的實用技巧

          發布時間: 2024-06-12  點擊次數: 24次

          1、提高實驗的效率

          1)實驗前有計劃安排、預備方案或者“車輪戰"(細胞實驗)

          一般從基礎的培養細胞開始,開始實驗時,實驗方法一般來自于實驗室或者文獻中條件優化以及自我推測及驗證,因此做實驗之前預想實驗方案有助于我們不至于“手忙腳亂"。


          以實驗前的細胞鋪板實驗為例:

          表1 常用細胞培養體系:

          提高效率與質量的實用技巧

          細胞鋪板的孔數一般取決于我們后期實驗的目的,實驗前了解各類細胞的鋪板數量以及培養基添加量都十分重要。以病毒或者細菌感染細胞模型來說,我們需要一個比較準確數量級的細胞數目和病毒或菌液濃度得后期實驗的MOI值,細胞計數和病毒及菌液濃度測定也很關鍵;


          細胞鋪板:我們需要收集盡可能多的細胞,原因是當我們剩余出來的細胞可用于細胞傳代繼續保留,可若是鋪板數量達不到(重新離心收集細胞浪費時間)可能會導致加藥濃度過大使得細胞大量死亡而影響后期實驗,比如你要提取RNA或者蛋白,細胞數目不足,后期的RNA濃度或者BCA測蛋白濃度的結果都不是非常理想繼而影響后面實驗的進展。


          2)具體安排(Western blot實驗)

          從試驗干擾開始(給藥處理),根據實驗步驟來講,完整的Western blot實驗預計2-3天。

          (1)以給藥時間24h為例:24h后,收集細胞提取蛋白,貼壁細胞加IP裂解液或RIPA裂解液用細胞刮板移至1.5ml離心管;懸浮細胞收集細胞至離心管離心去除培養基,用PBS清洗離心去除上清再加入裂解液,預計提取蛋白以及BCA測蛋白濃度一上午的時間,估計上樣體積加入loading buffer煮蛋白置于-80℃保存;下午跑蛋白電泳,SDS-PAGE膠可于前一天晚上制好防止-4℃冰箱保存(用少量純水用封裝袋保存)或使用預制膠,大概1多小時蛋白maker跑到距離膠最下面1-2cm處停止電泳;轉模,根據目的蛋白的大小確定轉膜時間和毫安數,結束后裁膜用5%脫脂奶粉封閉,之后孵育一抗4℃過夜,第二天洗膜孵育二抗并進行顯影,因此步驟時間熟練的話2天就可以完成一次WB實驗。

          (2)預備方案:實驗重復是不可避免的,因此預備下一周期實驗方案(車輪戰)有助于縮短時間提高效率,當然,師兄師姐以及廣大學術里的經驗小tips也有助于提高實驗效率。例如,在WB配制SDS-PAGE膠的凝固時間通常會隨季節溫度的變化而改變,夏季和冬季應該時間就會產生差異(冬季凝固較慢),再者,AP 和TEMED 作為促凝劑,一般都是最后加入,尤其是AP(過硫酸銨)。實驗之前我們可能都會設計一個預期結果,我們可以在上一周期實驗的空余時間預備下一周所需要的實驗條件,例如重新細胞鋪板給藥等待時間周期等等。

          2、提高實驗結果的質量:減小系統誤差,消除人為錯誤

          以qPCR為例:該實驗檢測基因的mRNA表達水平,操作過程要求一定的準確性,因為加樣體系較小,各試劑的加樣量更要求精準,下面是一些來自個人的小tips:

          ①減小系統誤差:一般設計3個重復孔,但是后期我統計數據時發現,誤差bar仍可能較長,這時我們可以設計4個復孔,去除一個誤差最大的值也有助于結果的準確性。這時就要求我們會更加精準的使用移液槍。另外,重復實驗也有助于提高我們加樣的準確性。

          ②制備預混液:例如我要做30(2×5×3)孔兩個基因(包含內參),5個處理,3個復孔,那么我的熒光染料一個孔需要5ul,正反引物2ul,那么我們可以再不浪費試劑的情況下,計算量可為:15.5×5+15.5×2或者(15×5+15×2)×1.1,這一定程度上都是為了消除我們人為加樣誤差。

          ③另外我們盡量增大加樣體積減少誤差:針對于10ul體系,提前將正反引物混合,配制SYBY+正反引物和cDNA+ddH2O,這時的體積為6+4或者7+3可減少加樣體積小帶來的加樣誤差。

          ④相關試劑使用前需離心使用:另外,在八聯管上機前需要用干凈的手套蓋上透明蓋子,適當離心將反應體系離心至管底。

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